Question

【題目】金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問題：

（1）從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過___________獲得___________用于PCR擴(kuò)增。

（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)?/span>___________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成___________，而造成引物自連。

（3）圖中步驟1代表高溫變性，可以使雙鏈___________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。

（4）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會(huì)破壞___________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但___________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有___________（填序號(hào)：①升高退火溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物）。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補(bǔ)配對(duì) 解旋 引物與模板 GC含量高 ②③

【解析】

PCR技術(shù)是多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，要先制備目的基因作為模板。

（1）用mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA的過程是逆轉(zhuǎn)錄的過程。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要先對(duì)目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，因此在引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼盖悬c(diǎn)，便于切割和連接。設(shè)計(jì)的引物之間不能堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物自連后，無法與模板連接。

（3）步驟1是高溫變性，使模板DNA雙鏈氫鍵打開而解旋。

（4）退火的目的是使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上，因此退火溫度過高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)。G-C之間有3個(gè)氫鍵，A-T之間2個(gè)氫鍵，氫鍵越多結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，因此對(duì)于GC含量高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（5）根據(jù)上述題的分析，如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，有可能是引物間自連，也可能是退火溫度過高造成的，因此要采取②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物的改進(jìn)措施。