Question

【題目】金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題：

（1）設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當的______________位點。設計引物時需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。

（2）圖中步驟1代表______________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環。

（3）PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞引物與模板之間的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但____________的引物需要設定更高的退火溫度。

（4）如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有_____(填序號：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設計引物)。

Answer 1

【答案】 限制性核酸內切酶 堿基互補配對 變性 GC含量高 ②③

【解析】試題分析：圖中代表PCR技術流程，步驟1代表模板DNA在94℃的高溫下變性，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環。

（1）引物的作用是作為DNA復制的起點，由于目的基因前端插入了引物，所以在構建重組質粒時，要在引物中增加適當的限制性核酸內切酶的酶切位點，保證目的基因完整地插入到重組質粒中；設計引物時要注意避免引物之間堿基互補配對，形成環狀DNA，使其無法插入重組質粒中。

（2）步驟1所示模板DNA在94℃的高溫下變性，使DNA斷開雙鏈結構。

（3）PCR的退火過程中，進行的是引物與模板鏈的結合，如果溫度過高，會破壞引物與模板鏈之間的堿基配對；由于堿基之間是以氫鍵連接的，堿基A與T之間以兩個氫鍵連接，堿基C與G之間以三個氫鍵連接，相比之下C與G之間穩定性更高，所以長度相同但堿基G與C含量高的引物需要設定更高的退火溫度。

（4）如果PCR反應得不到任何擴增產物，則說明退火過程出現問題，由于退火溫度過高導致引物與模板鏈無法結合，或是由于引物設計的不合理，使其無法和模板鏈互補結合。