Question

【題目】隨著基因工程、細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物科技的發(fā)展，人們生活中一些難以治愈的疾病有了一些新的治療手段，其中基因打靶是一項常用的技術(shù)手段。基因打靶技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上而發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)。結(jié)合下圖回答下列問題：

注：neo＇是新霉素抗性基因；HSV-tK基因的表達(dá)可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

（1）將目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的DNA片段都重組到質(zhì)粒上，構(gòu)建打靶載體（基因表達(dá)載體），該過程需要用到的工具酶有______________________。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用_________酶，將之線性化，以提高重組率。然后通過_______技術(shù)將其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，這樣打靶載體與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有概率發(fā)生同源重組。

（3）為了篩選發(fā)生同源重組的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中加入________進(jìn)行初步篩選。最后還需要通過________技術(shù)鑒定同源重組的細(xì)胞（去除靶基因的細(xì)胞），將這樣的細(xì)胞通過擴(kuò)大化培養(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細(xì)胞。其中，暫時不用的細(xì)胞進(jìn)行_____________保存。

（4）將打靶成功的細(xì)胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、__________的母鼠體內(nèi)，一段時間后對受體母鼠進(jìn)行 ___________檢查，確保其生下嵌合小鼠。

Answer 1

【答案】 限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶 限制 顯微注射 新霉素和丙氧鳥苷 DNA分子雜交 液氮（或冷凍） 生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情） 是否妊娠

【解析】本題考查基因工程和胚胎工程的操作步驟和流程，意在考察考生對中知識點的理解和應(yīng)用能力。

（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要用同種限制性內(nèi)切酶對目的基因和運(yùn)載體進(jìn)行切割，然后用DNA連接酶將目的基因和運(yùn)載體相連接。

（2）打靶載體測序驗證正確后，原來是環(huán)狀的，可以利用限制酶將其切開線性化。目的基因要導(dǎo)入動物細(xì)胞中需用顯微注射法。

（3）由圖可知重組后的DNA中含有新霉素抗性基因和但無HSV-tK基因，所以可在培養(yǎng)液中加入新霉素和丙氧鳥苷，如果細(xì)胞能存活下來，初步證明重組成功。需要進(jìn)一步篩選需要用DNA分子雜交技術(shù)，可以確定看是否存在靶基因。對于暫時不用的細(xì)胞可以在液氮中進(jìn)行冷凍保存。

（4）胚胎移植時，需要移植到同種、生理狀態(tài)相同的母鼠體內(nèi)，可以用性激素進(jìn)行同期發(fā)情處理得到。一段時間后對受體母鼠進(jìn)行是否妊娠檢查，確保能生下嵌合小鼠。