Question

【題目】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖 1、圖 2 中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題：

(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用____________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過______________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入經____________處理過的_____________態的大腸桿菌中。

(2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加________________________。平板上長出的菌落，常用 PCR 鑒定，所用的引物組成為圖2中的_____________。

(3)若BamH I 酶切的 DNA 末端與 Bcl I 酶切的 DNA 末端連接，連接部位的 6 個堿基對序列為______________________，對于該部位，這兩種酶__________（填“都能”、 “都不能”或“只有一種能”）切開。

(4)若用 Sau3A I 切圖 1 質粒最多可能獲得________________種大小不同的 DNA 片段。

(5)圖1中啟動子的作用是__________________________________________________________。

(6)將目的基因導入棉花細胞，培育抗蟲棉的過程涉及到哪些技術：_______________________________

Answer 1

【答案】Bcl I和Hand IIIDNA連接Ca+感受四環素引物甲和引物丙都不能7為RNA聚合酶提供識別和結合的部位，驅動轉錄基因工程技術(轉基因技術)和植物組織培養技術

【解析】

分析圖1：外源DNA上含有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII和Sau3AI的切割位點，其中限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII的識別序列都能被Sau3kI識別。分析圖2：質粒上有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII三種限制酶的識別序列和切割位點，其中BamHⅠ的切割位點位于兩種抗生素抗性基因上，而抗性基因為載體的標記基因，因此不可用該酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamHI、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點。

（1）選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質粒中的啟動子丟失，且會破壞質粒中的兩個抗性基因；Sau3AI在質粒上有三個酶切位點，也會破壞質粒中的兩個抗性基因，不利于后期的篩選，所以應選用限制酶為BclⅠ和Hind Ⅲ。選擇的限制酶應在目的基因兩側切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接。為了擴增重組質粒，需將其轉入經鈣離子處理過的感受態的大腸桿菌中。

（2）由上一問的討論可知，重組質粒的氨芐青霉素抗性基因已經破壞，僅保留了四環素抗性基因，為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加四環素。平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物需要與單鏈兩端相應互補序列結合，故所用引物組成是圖2中的引物甲和引物丙。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為，由于兩種酶均不能識別該部位的堿基對序列，所用兩種酶都不能切開該部位。

（4）根據BclI、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點，Sau3AⅠ在質粒上有三個酶切位點，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3AⅠ切質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。

（5）啟動子的作用是為RNA聚合酶提供識別和結合的部位，驅動轉錄。

（6）將目的基因導入棉花細胞，需要基因工程技術(轉基因技術)；將得到的轉基因細胞培育成抗蟲棉植株的過程涉及到植物組織培養技術。