Question

【題目】基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來(lái)研究該病的基因治療過(guò)程。定點(diǎn)整合的過(guò)程是：從染色體DNA上突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因、連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示。

（1）構(gòu)建重組載體時(shí)，常用的工具酶有________。該實(shí)驗(yàn)用小鼠胚胎干細(xì)胞作為PKU基因的受體細(xì)胞以培育出轉(zhuǎn)基因小鼠，除了胚胎干細(xì)胞能大量增殖外，還因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞_________。

（2）為獲得小鼠的胚胎干細(xì)胞，可將小鼠囊胚中的_________取出，并用_________處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中大部分細(xì)胞會(huì)貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為___________。

（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)PKU基因錯(cuò)誤整合。錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)中至少會(huì)有一個(gè)與一起整合到染色體DNA上。已知含有的細(xì)胞具有G418的抗性，、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞依次在含有G418及同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來(lái)的是__________的胚胎干細(xì)胞，理由是_________。

（4）將篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成小鼠，從個(gè)體生物學(xué)水平檢測(cè)，若小鼠__________，說(shuō)明PKU基因成功表達(dá)。

Answer 1

【答案】限制酶和DNA連接酶 具有全能性 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞 胰蛋白酶或膠原蛋白酶 貼壁生長(zhǎng) 正確互換整合 正確互換整合后的染色體上只有只有，無(wú)、，具有G418抗性，故能在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，錯(cuò)誤互換整合后的細(xì)胞中染色體DNA上含有和至少1個(gè)，而、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)，故在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中錯(cuò)誤整合的細(xì)胞死亡 尿液中霉臭味顯著降低

【解析】

DNA重組技術(shù)至少需要三種工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運(yùn)載體。構(gòu)建重組載體時(shí)，首先需用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和運(yùn)載體，再用DNA連接酶連接目的基因和運(yùn)載體形成重組載體。胚胎干細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)ES或EK細(xì)胞，來(lái)源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)），因此獲取的胚胎干細(xì)胞應(yīng)取自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。結(jié)合題圖可知，正常互換后的染色體DNA上只有，而無(wú)、；錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)中至少會(huì)有一個(gè)與一起整合到染色體DNA上，故由于正確互換后的細(xì)胞染色體上有，無(wú)、，故對(duì)G418有抗性，可在含G418的培養(yǎng)液中正常生活，而錯(cuò)誤互換后的染色體DNA上由于含有至少1個(gè)，而、的產(chǎn)物都能使細(xì)胞死亡，故錯(cuò)誤互換的細(xì)胞不能生存，據(jù)此分析。

（1）構(gòu)建重組載體時(shí)，常用的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶。實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎干細(xì)胞作為PKU基因的受體細(xì)胞，除了胚胎干細(xì)胞能大量增殖外，還因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞具有全能性。

（2）為獲得小鼠的胚胎干細(xì)胞，可將小鼠囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞取出，并用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中大部分細(xì)胞會(huì)貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為貼壁生長(zhǎng)。

（3）已知含有的細(xì)胞具有G418的抗性，、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡，據(jù)分析可知，正確互換后的染色體上只有只有，無(wú)、，錯(cuò)誤互換后的細(xì)胞中染色體DNA上含有和至少1個(gè)，因此，轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞依次在含有G418及同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來(lái)的是正常互換整合的胚胎干細(xì)胞，原因是：正確互換后的染色體上只有只有，無(wú)、，具有G418抗性，故能在含有G418及同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，錯(cuò)誤互換后的細(xì)胞中染色體DNA上含有和至少1個(gè)，而、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)，因此在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中死亡。

（4）苯丙酮尿癥是由于苯丙氨酸代謝途徑中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積，并從尿中大量排出，主要表現(xiàn)為智力低下，尿液中有霉臭味，將篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成小鼠，若PKU基因成功表達(dá)，則從個(gè)體生物學(xué)水平檢測(cè)，小鼠尿液中霉臭味顯著降低。