Question

【題目】人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染的最有效方法。下圖為“轉基因酵母乙肝疫苗”的生產過程示意圖，該過程所用酵母菌為畢赤酵母菌，其體內無天然質粒，科學家改造出了下圖所示的pPIC9K質粒（松弛控制型，復制不受宿主細胞控制）用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發生同源重組，將目的基因整合與染色體組已實現表達。請回答下列問題：

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上限制酶_________的識別序列，這樣設計的優點是可避免質粒和目的基因的自身環化。步驟1應選用___________（填“Ecoli”或“T4”）DNA連接酶。

（2）步驟2的目的是______________________。已知大腸桿菌每20分鐘分裂一次，若1個大腸桿菌中導入了 10個重組質粒，則1小時后可從1個大腸桿菌的后代中得到重組質粒的個數___________。

（3）步驟4中應選用限制酶___________切割重組質粒以獲得一段線性DNA，然后將其導入畢赤酵母菌細胞。為了確認畢赤酵母菌轉化是否成功，應在培養基中加入___________以便篩選。除此以外，還可以用分子雜交技術鑒定上圖中的畢赤酵母菌轉化是否成功，過程如下圖所示:

根據圖中顯示結果推算，若要獲得16個成功導入該基因的酵母菌菌落，則上圖中的酵母菌菌落數至少要為___________個。

（4）已知質粒在細胞傳代過程中有丟失現象，試分析畢赤酵母表達系統的遺傳穩定性高于大腸桿菌表達系統的主要原因_________________________________。

Answer 1

【答案】 SnaBr和AvrⅡ T4 獲得大量重組質粒（擴增） 不確定 BglⅡ 卡拉霉素 120 目的基因整合到酵母染色體上，不易丟失

【解析】試題分析：重組質粒上的目的基因若要表達，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子。分析題圖，圖中質粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位點，其中SacⅠ位于啟動子上，BglⅡ不在啟動子與終止子之間，因此要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，同時防止自身環化，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割質粒，則應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列。

（1）根據以上分析已知，在HBsAg基因兩側的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列；根據表格分析可知，SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶切割后漏出的分別是平末端和粘性末端，因此步驟1構建基因表達載體時，應該用T4 DNA連接酶。

（2）步驟2將重組質粒導入大腸桿菌，讓其在大腸桿菌體內復制，以獲得大量的重組質粒。已知大腸桿菌中導入了10個重組質粒，且20分鐘分裂一次，但是不能確定細胞分裂過程中重組質粒是否都復制，且是否平均分配到子細胞中去，因此不能確定1小時后可從1個大腸桿菌的后代中得到重組質粒的個數。

（3）根據鏈狀DNA兩端的箭頭和圖紋可知，切割其的限制酶是BglⅡ；切割后仍然具有卡拉霉素抗性基因，但是丟失了氨芐青霉素抗性基因，因此為了確認畢赤酵母菌轉化是否成功，應在培養基中加入卡拉霉素以便篩選。根據圖形分析可知，15個酵母菌中有2個是畢轉化成功的赤酵母菌，因此若要獲得16個成功導入該基因的酵母菌菌落，則上圖中的酵母菌菌落數至少要為15÷2×16=120個。

（4）已知質粒在細胞傳代過程中有丟失現象，而畢赤酵母表達系統的遺傳穩定性高于大腸桿菌表達系統，說明目的基因整合到了酵母染色體上，不易丟失。